Biologi Molekular Teknik

Sejak akhir 1950-an dan awal 1960-an, ahli biologi molekuler telah belajar untuk mengkarakterisasi, mengisolasi, dan memanipulasi komponen molekul sel dan organisme. Komponen ini termasuk DNA , repositori informasi genetik, RNA , kerabat dekat dari DNA yang fungsinya berkisar dari melayani sebagai copy pekerjaan sementara DNA untuk fungsi struktural dan enzimatik aktual serta bagian fungsional dan struktural dari aparat translasi, dan protein, jenis struktural dan enzimatik utama molekul dalam sel.

Ekspresi kloning

Salah satu teknik yang paling dasar biologi molekuler untuk mempelajari fungsi protein adalah kloning ekspresi. Dalam teknik ini, DNA coding untuk protein bunga kloning (menggunakan PCR dan / atau pembatasan enzim) ke dalam plasmid (dikenal sebagai vektor ekspresi). Ini plasmid mungkin memiliki elemen promotor khusus untuk mendorong produksi protein yang menarik, dan mungkin juga memiliki penanda resistensi antibiotik untuk membantu mengikuti plasmid.

Ini plasmid dapat dimasukkan ke dalam sel bakteri baik atau hewan. Memperkenalkan DNA ke dalam sel bakteri dapat dilakukan dengan transformasi (melalui penyerapan telanjang DNA ), konjugasi (melalui kontak sel-sel) atau dengan transduksi (melalui vektor virus ). Memperkenalkan DNA ke dalam sel eukariotik, seperti sel-sel hewan, dengan cara fisik atau kimia yang disebut transfeksi. Beberapa teknik transfeksi berbeda yang tersedia, seperti kalsium fosfat transfeksi, elektroporasi, injeksi dan liposom transfeksi. DNA juga dapat diperkenalkan ke dalam sel eukariotik menggunakan virus atau bakteri sebagai pembawa, yang terakhir ini kadang-kadang disebut bactofection dan khususnya menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Plasmid dapat diintegrasikan ke dalam genom, menghasilkan transfeksi stabil, atau mungkin tetap independen dari genom, yang disebut transfeksi transien.

Dalam kedua kasus, DNA coding untuk protein yang menarik sekarang di dalam sel, dan protein sekarang dapat dinyatakan. Berbagai sistem, seperti promotor diinduksi dan spesifik sel-sinyal faktor, yang tersedia untuk membantu mengekspresikan protein kepentingan di tingkat tinggi. Jumlah besar protein yang kemudian dapat diekstrak dari sel bakteri atau eukariotik. Protein dapat diuji untuk aktivitas enzimatik bawah berbagai situasi, protein dapat mengkristal sehingga struktur tersier yang dapat dipelajari, atau, dalam industri farmasi, aktivitas obat baru terhadap protein dapat dipelajari.

Polymerase chain reaction (PCR)

Reaksi berantai polimerase adalah teknik yang sangat serbaguna untuk menyalin DNA. Dalam singkat, PCR memungkinkan satu DNA urutan yang akan disalin (jutaan kali), atau diubah dengan cara yang telah ditentukan. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk memperkenalkan situs enzim restriksi, atau untuk bermutasi (mengubah) basa tertentu DNA, yang terakhir adalah metode disebut sebagai "perubahan Cepat". PCR juga dapat digunakan untuk menentukan apakah suatu fragmen DNA tertentu ditemukan di perpustakaan cDNA. PCR memiliki banyak variasi, seperti PCR transkripsi terbalik (RT-PCR) untuk amplifikasi RNA, dan, baru-baru ini, real-time PCR (QPCR) yang memungkinkan untuk pengukuran kuantitatif molekul DNA atau RNA.

Gel elektroforesis

Elektroforesis gel adalah salah satu alat utama biologi molekuler. Prinsip dasarnya adalah bahwa DNA, RNA, dan protein semuanya dapat dipisahkan melalui medan listrik. Dalam elektroforesis gel agarosa, DNA dan RNA dapat dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menjalankan DNA melalui gel agarosa. Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran dengan menggunakan gel SDS-PAGE, atau atas dasar ukuran dan muatan listrik dengan menggunakan apa yang dikenal sebagai elektroforesis gel 2D.

Makromolekul blotting dan menyelidik

Istilah'' utara'','' Barat'' dan'''' timur blotting berasal dari apa yang awalnya adalah lelucon biologi molekuler yang dimainkan di'' istilah'' Southern blotting, setelah teknik yang dijelaskan oleh Edwin Selatan untuk dengan hibridisasi DNA dari dihapuskan. Patricia Thomas, pengembang RNA blot yang kemudian dikenal sebagai'' noda'' utara sebenarnya tidak menggunakan istilah. Kombinasi lebih lanjut dari teknik ini menghasilkan istilah-istilah seperti'''' southwesterns (protein-DNA hybridizations),'' northwesterns'' (untuk mendeteksi protein-RNA interaksi) dan farwesterns'' (protein-protein interaksi),'' semuanya saat ini ditemukan dalam literatur.
Southern blotting

Dinamai setelah penemunya, biologi Edwin Selatan, Southern blot adalah metode untuk mencari-cari keberadaan urutan DNA tertentu dalam DNA sampel. DNA sampel sebelum atau setelah enzim restriksi pencernaan dipisahkan dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke membran dengan blotting melalui kapiler. Membran tersebut kemudian terkena probe DNA berlabel yang memiliki urutan basa pelengkap urutan DNA pada bunga. Protokol yang paling asli yang digunakan label radioaktif, namun non-radioaktif alternatif yang sekarang tersedia. Southern blotting yang kurang umum digunakan dalam ilmu laboratorium karena kapasitas teknik lain, seperti PCR, untuk mendeteksi urutan DNA tertentu dari DNA sampel. Ini bercak masih digunakan untuk beberapa aplikasi, bagaimanapun, seperti mengukur jumlah salinan transgen pada tikus transgenik, atau rekayasa gen KO sel induk embrio baris.
Northern blotting

Blot utara ini digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis tertentu molekul RNA sebagai perbandingan relatif antara satu set sampel yang berbeda dari RNA. Ini pada dasarnya adalah kombinasi dari elektroforesis gel denaturasi RNA, dan noda a. Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel dari urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun, hasil yang paling dalam wahyu dari band yang mewakili ukuran dari RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berhubungan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini biasanya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak bahwa RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Ini adalah salah satu alat yang paling dasar untuk menentukan jam berapa, dan dalam kondisi apa, beberapa gen yang diekspresikan dalam jaringan hidup.

Western blotting

Antibodi untuk kebanyakan protein dapat dibuat dengan menyuntikkan sejumlah kecil protein menjadi binatang seperti tikus, kelinci, domba, keledai atau (antibodi poliklonal) atau diproduksi dalam kultur sel (antibodi monoklonal). Antibodi ini dapat digunakan untuk berbagai teknik analitis dan preparatif.

Dalam western blotting, protein yang pertama dipisahkan berdasarkan ukuran, dalam gel tipis terjepit di antara dua pelat kaca dalam teknik yang dikenal sebagai SDS-PAGE (sodium sulfat poliakrilamida gel elektroforesis dodesil). Protein dalam gel tersebut kemudian ditransfer ke PVDF, nitroselulosa, nilon atau membran pendukung lainnya. Membran ini kemudian dapat diperiksa dengan solusi antibodi. Antibodi yang secara khusus mengikat protein bunga maka dapat divisualisasikan dengan berbagai teknik, termasuk produk berwarna, chemiluminescence, atau autoradiografi. Seringkali, antibodi diberi label dengan enzim. Ketika substrat chemiluminescent terkena enzim itu memungkinkan deteksi. Menggunakan teknik western blotting memungkinkan tidak hanya mendeteksi tetapi juga analisis kuantitatif.

Analog dengan metode western blotting dapat digunakan untuk langsung noda protein tertentu dalam sel hidup atau bagian jaringan. Namun,'' immunostaining metode'', seperti IKAN, lebih sering digunakan dalam penelitian biologi sel.
Eastern blotting

Teknik Timur blotting adalah untuk mendeteksi modifikasi pasca-translasi protein. Protein dihapuskan ke PVDF atau membran nitroselulosa yang diperiksa untuk modifikasi menggunakan substrat tertentu.
Array

Sebuah array DNA adalah kumpulan bintik-bintik yang melekat pada sebuah pendukung padat seperti slide mikroskop mana tempat masing-masing berisi satu atau lebih DNA beruntai tunggal oligonukleotida fragmen. Array memungkinkan untuk meletakkan jumlah besar tempat yang sangat kecil (100 diameter micrometre) pada satu slide. Tempat masing-masing memiliki molekul DNA fragmen yang melengkapi urutan DNA tunggal (mirip dengan blotting Selatan). Sebuah variasi dari teknik ini memungkinkan ekspresi gen dari suatu organisme pada tahap tertentu dalam pengembangan untuk memenuhi syarat (profiling ekspresi). Dalam teknik ini RNA dalam jaringan adalah terisolasi dan diubah menjadi cDNA berlabel. Ini cDNA ini kemudian hibridisasi dengan fragmen di array dan visualisasi hibridisasi dapat dilakukan. Sejak beberapa array dapat dibuat dengan posisi yang sama persis fragmen mereka sangat berguna untuk membandingkan ekspresi gen dari dua jaringan yang berbeda, seperti jaringan sehat dan kanker. Juga, kita dapat mengukur apa gen disajikan dan bagaimana perubahan ekspresi yang dengan waktu atau dengan faktor-faktor lainnya. Misalnya, ragi roti yang umum itu,'' Saccharomyces cerevisiae'', mengandung sekitar 7000 gen, dengan microarray, orang dapat mengukur secara kualitatif bagaimana gen setiap diungkapkan, dan bagaimana bahwa perubahan ekspresi, misalnya, dengan perubahan suhu.

Ada banyak cara untuk membuat microarray, yang paling umum adalah silikon chip, mikroskop slide dengan bintik-bintik dari ~ 100 diameter micrometre, array kustom, dan array dengan bintik-bintik yang lebih besar pada membran berpori (macroarrays). Ada bisa dimana saja dari 100 spot ke lebih dari 10.000 pada array yang diberikan.

Array juga dapat dibuat dengan molekul lain selain DNA . Sebagai contoh, sebuah antibodi array yang dapat digunakan untuk menentukan apa yang protein atau bakteri yang hadir dalam sampel darah.
Alel spesifik oligonukleotida

Alel oligonukleotida spesifik (ASO) adalah teknik yang memungkinkan deteksi mutasi basa tunggal tanpa memerlukan PCR atau elektroforesis gel. Pendek (20-25 nukleotida panjang), probe berlabel dihadapkan pada DNA target non-terfragmentasi. Hibridisasi terjadi dengan kekhususan tinggi karena panjang pendek dari probe dan bahkan perubahan basa tunggal akan menghambat hibridisasi. DNA target kemudian dicuci dan probe label yang tidak berhibridisasi dihapus. DNA target kemudian dianalisa untuk kehadiran probe melalui radioaktivitas atau fluoresensi. Dalam percobaan ini, seperti dalam kebanyakan teknik biologi molekular, kontrol harus digunakan untuk memastikan keberhasilan eksperimen. The Assay Metilasi Illumina adalah contoh dari sebuah metode yang mengambil keuntungan dari teknik ASO untuk mengukur perbedaan satu pasangan basa secara berurutan.
Kuno teknologi

Dalam biologi molekuler, prosedur dan teknologi yang terus-menerus teknologi maju dan lebih tua ditinggalkan. Misalnya, sebelum munculnya gel elektroforesis DNA (agarosa atau poliakrilamida), ukuran DNA molekul yang biasanya ditentukan oleh tingkat sedimentasi di gradien sukrosa, teknik lambat dan padat karya yang membutuhkan instrumentasi mahal, sebelum gradien sukrosa, viskometer digunakan .

Selain dari kepentingan sejarah mereka, sering worth mengetahui tentang teknologi yang lebih tua, karena kadang-kadang berguna untuk memecahkan masalah lain yang baru teknik baru yang pantas.

http://www.news-medical.net/health/Molecular-Biology-Techniques.aspx